抗體偶聯(lián)藥物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）是近年來腫瘤靶向治療領(lǐng)域發(fā)展最快的藥物類別之一。連接子(Linker)連接著細(xì)胞毒性藥物和抗體，是ADC藥物的關(guān)鍵部件之一。ADC中的連接子可分為可裂解和不可裂解兩種形式，目前的ADC研究主要集中在可裂解連接子上。而在可裂解連接子中，組織蛋白酶可裂解連接子是目前應(yīng)用最-廣泛以及研究最深入的，其中組織蛋白酶B發(fā)揮著至關(guān)重要的“切割"作用。

ADC藥物簡介

抗體偶聯(lián)藥物（Antibody-Drug Conjugate，ADC）由靶向腫瘤特異性抗原或者靶向腫瘤相關(guān)抗原的單克隆抗體(Antibody)，與不同數(shù)目的小分子細(xì)胞毒素(Payload)通過連接子(Linker)偶聯(lián)而成（圖1），兼具傳統(tǒng)小分子藥物的殺傷效應(yīng)和抗體藥物的靶向性，已成為腫瘤靶向治療的重要藥物之一。ADC藥物的核心作用機制是在胞內(nèi)釋放出活性細(xì)胞毒素(Payload)，干擾關(guān)鍵細(xì)胞機制，從而殺死靶細(xì)胞。因此，Payload的釋放機制是ADC藥物研發(fā)的關(guān)鍵點。

圖1 ADC藥物的結(jié)構(gòu)和功能示意圖（來源：Antibody drug conjugate: the“biological missile" for targeted cancer therapy）

Payload的釋放機制因連接子類型而異。ADC中的連接子可分為可裂解和不可裂解兩種形式?？闪呀膺B接子主要為敏感性的化學(xué)鍵，可以根據(jù)體內(nèi)環(huán)境的特異性化學(xué)物種（如谷胱甘肽、酸堿性等）或酶濃度不同，促進(jìn)連接子與藥物裂解，主要通過腙鍵、二硫鍵、多肽的形式連接。不可裂解連接子沒有可觸發(fā)裂解的內(nèi)置化學(xué)鍵，需要在癌細(xì)胞的溶酶體中將抗體通過蛋白質(zhì)水解機制變成氨基酸，進(jìn)而釋放帶有連接子和氨基酸片段的細(xì)胞毒性藥物，主要通過硫醚的形式連接。

【可裂解連接子】

腙鍵特點：對pH值敏感。在血液環(huán)境（pH 7.35-7.45）穩(wěn)定，而在酸性細(xì)胞區(qū)室，例如溶酶體(pH 4.5-5.0)中會被水解釋放Payload; 腙鍵連接子在血液循環(huán)過程中并不穩(wěn)定，易造成脫靶效應(yīng)，目前其應(yīng)用主要局限于血液瘤。

二硫鍵特點：可被谷胱甘肽(GSH)還原裂解。胞外體液環(huán)境中谷胱甘肽的濃度為2-20μmo/L，遠(yuǎn)低于細(xì)胞質(zhì)中谷胱甘肽的濃度(1-10 mmol/L)，而腫瘤細(xì)胞中GSH濃度會更高，從而還原切割二硫鍵，促進(jìn)Payload的釋放。因此，二硫鍵連接子在循環(huán)系統(tǒng)中相對穩(wěn)定，并具有一定腫瘤特異性。

糖苷鍵特點：可被β-葡萄糖醛酸酶和β-半乳糖苷酶切割。含有β-葡萄糖醛酸的連接子具有很高的親水性，可減少ADC的聚集，同時具有很好的穩(wěn)定性。

肽鍵特點：可被組織蛋白酶B切割，這是一種溶酶體蛋白酶，在腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)，而在血液中存在蛋白酶抑制劑。因此，這種連接子在循環(huán)系統(tǒng)中高度穩(wěn)定，而進(jìn)入腫瘤細(xì)胞后會被溶酶體組織蛋白酶B切割，從而實現(xiàn)細(xì)胞毒性藥物在癌細(xì)胞中靶向釋放的功能。

【不可裂解連接子】

硫醚鍵特點：該類型連接子ADC的藥效發(fā)揮依賴于內(nèi)吞機制，經(jīng)腫瘤細(xì)胞內(nèi)吞后進(jìn)入溶酶體，ADC的抗體部分被降解，釋放出包含細(xì)胞毒素、linker和氨基酸殘基的復(fù)合物。這種連接子在血液環(huán)境中更加穩(wěn)定，但帶電荷的氨基酸殘基會影響細(xì)胞毒素的細(xì)胞穿透膜能力，導(dǎo)致其不能發(fā)揮效“旁觀者效應(yīng)"。

目前，組織蛋白酶B可裂解連接子是應(yīng)用最-廣泛以及研究最深入的，同時也是目前唯-一有實際應(yīng)用于上市ADC藥物的酶裂解型連接子。目前全球已上市的ADC藥物達(dá)15款，其中有8款是組織蛋白酶B可裂解的Linker（表1）。下面，讓我們一起來揭開具有強大“切割"力量的組織蛋白酶B的神秘面紗。

表1  全球已上市的ADC藥物一覽

組織蛋白酶B：背后蘊藏的“切割"力量

組織蛋白酶B（Cathepsin B）是一種半胱氨酸組織蛋白酶，屬于半胱氨酸蛋白酶家族，是一種胞內(nèi)酶，主要分布于細(xì)胞溶酶體中。在病變情況下，也會分泌到細(xì)胞膜外周微環(huán)境或者胞外。組織蛋白酶B由一個重鏈和一個輕鏈組成的二聚體，具有羧基肽酶和內(nèi)肽酶活性。羧基肽酶活性使得組織蛋白酶B可選擇性識別某些氨基酸序列以切割序列 C 端側(cè)的肽鍵接頭，例如纈氨酸-瓜氨酸（Val-Cit）、纈氨酸-丙氨酸（Val-Ala）和甘氨酸-甘氨酸-苯丙氨酸-甘氨酸（GGFG）等。這些Linker在已獲批的ADC中廣泛應(yīng)用，具體裂解過程如圖2所示。內(nèi)肽酶活性則使組織蛋白酶B參與細(xì)胞外基質(zhì)的降解，從而涉及腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

圖2 組織蛋白酶B催化肽鍵連接子的裂解過程示意圖（來源：抗體偶聯(lián)藥物連接技術(shù)的研究進(jìn)展）

由于組織蛋白酶B在多種腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)，如乳腺癌、肝癌、肺癌、黑色素瘤、胰腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、結(jié)直腸癌、宮頸癌、甲狀腺癌等，并且是一種特異性的胞內(nèi)酶，因此是現(xiàn)在ADC藥物研發(fā)主要考慮的Linker裂解酶，可以實現(xiàn)特異性和高效的胞內(nèi)切割。另外，其他處于早期研究的Linker裂解酶還有組織蛋白酶M、組織蛋白酶L、β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、硫酸酯酶、磷酸酶和天冬酰胺內(nèi)肽酶（萊古酶）等。

IPHASE相關(guān)產(chǎn)品

鑒于此，IPHASE作為體外研究生物試劑引-領(lǐng)者，憑借先進(jìn)的設(shè)備、專業(yè)的技術(shù)人員和多年研發(fā)經(jīng)驗，自主研發(fā)了重組人組織蛋白酶B（Human Cathepsin B），該產(chǎn)品采用HEK293細(xì)胞表達(dá)，更接近蛋白天然構(gòu)象，可用于評估ADC藥物連接子切割效果，保證payload在胞內(nèi)高效釋放；

IPHASE技術(shù)人員通過測定底物Z-RR-AMC的代謝減少速率來評估組織蛋白酶B的活性。孵育體系中組織蛋白酶B終濃度為2μg/ml，底物Z-RR-AMC終濃度為1μM，孵育時間為60min，最終測得組織蛋白酶B的活性為8000pmol/min/mg。

除了組織蛋白酶B（Cathepsin B）外，針對ADC藥物中payload其他釋放形式、代謝穩(wěn)定性、血漿蛋白結(jié)合等方向的研究，IPHASE推出了肝溶酶體、肝S9、酸化肝勻漿液，肝微粒體及空白血漿等產(chǎn)品，全面助力客戶ADC藥物開發(fā)研究！

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參考資料：

[1] Zhiwen Fu, Shijun Li, Sifei Han, et al. Antibody drug conjugate: the“biological missile" for targeted cancer therapy. Signal Transduction and Targeted Therapy.2022,7(1):93

[2] 李云峰，辛杰，李靜，等. 抗體偶聯(lián)藥物連接技術(shù)的研究進(jìn)展[J]．中國新藥與臨床雜志，2022, 41(12): 719-728.

[3] Mckertish, C.M.; Kayser, V. Advances and Limitations of Antibody Drug Conjugates for Cancer. Biomedicines 2021, 9, 872.

[4] Baah, S.; Laws, M.; Rahman, K.M. Antibody–Drug Conjugates—A Tutorial Review. Molecules. 2021, 26, 2943.

[5] Bargh J D, Isidro-LIobet A, Parker J S, et al. Cleavable linkers in antibody–drug conjugates. Chemical Society Reviews. 2019, 48(16):4361-4374.

[6] Zheng Su, Dian Xiao, Fei Xie, et al., Antibody-drug conjugates: Recent advances in linker chemistry. Acta Pharm Sin B. 2021.11(12): 3889-3907.

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